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Niemann-Pick C

La inhibición de la quinasa ABL al factor TFEB y promueve la limpieza celular en la enfermedad lisosomal de Niemann-Pick C

Los lisosomas son organelos celulares que juegan un rol fundamental en la homeostasis celular al estar involucrados en procesos tales como: la reparación de la membrana plasmática, la degradación y el reciclaje de nutrientes, el metabolismo de macromoléculas y la autofagia. Deficiencias en proteínas lisosomales generan la acumulación de diversos tipos de moléculas en este organelo y son la causa de diferentes enfermedades lisosomales, tales como Niemann-Pick tipo C (NPC), la cual se caracteriza por presentar acumulación de colesterol lisosomal debido a mutaciones en los genes que codifican para las proteínas NPC1 ó NPC2. Interesantemente, en el último tiempo se ha descrito al factor de transcripción EB (TFEB) como el regulador maestro de la biogénesis lisosomal y de la expresión de genes involucrados en la autofagia.

La actividad de TFEB y su translocación al núcleo depende de su estado de fosforilación en las serinas 211 y 142, las que son fosforiladas principalmente por la serina/treonina quinasa mTORC1. En condiciones basales, TFEB está fosforilado en las serinas mencionadas anteriormente y se mantiene en el citoplasma debido a su acoplamiento a la chaperona citosólica 14-3-3. En nuestro laboratorio se ha descrito previamente la activación de la tirosina quinasa ABL en la enfermedad NPC. La inhibición de ABL usando Imatinib, un inhibidor específico de la quinasa, previene la muerte neuronal en el cerebelo, y promueve una mejora de las habilidades motoras y la sobrevida de los ratones modelo de la enfermedad. Adicionalmente, se ha descrito que el uso de inhibidores farmacológicos de ABL inducen el flujo autofágico y el incremento en la cantidad de lisosomas. Sin embargo, el mecanismo celular por el cual la inhibición de ABL estaría induciendo estos cambios aún se desconoce.

Tomando en cuenta esta información y resultados preliminares, nos planteamos la siguiente hipótesis: “La señalización de ABL promueve la localización citoplasmática deTFEB inhibiendo la limpieza celular y contribuyendo a la patogenia de la de Niemann-Pick C”. Para corroborar nuestra hipótesis, primero evaluamos la translocación de TFEB al núcleo mediante la técnica de high-content screening utilizando distintos inhibidores de ABL. Encontramos que la inhibición de ABL mediante distintos inhibidores promueven la translocación de TFEB al núcleo. Encontramos los mismos resultados mediante fraccionamiento núcleo citoplasma, y al evaluar TFEB endógeno.

Adicionalmente, al utilizar un siRNA contra ABL1 observamos el mismo fenómeno de translocación al núcleo y un incremento de la expresión de los genes blanco de TFEB. Estos resultados indican que la inhibición de ABL promueve la activación de TFEB. Luego, evaluamos procesos biólogicos descritos rio abajo de la activación de TFEB en condiciones de inhibición de ABL. Observamos que la inhibición de ABL incrementa el flujo autofágico en células H4 que sobreexpresan establemente el plásmido LC3-GFPmRFP. Además, la inhibición de ABL utilizando Imatinib o un siRNA contra ABL1, incrementó los niveles proteicos de los lisosomas, lo que fue evaluado siguiendo los niveles de LAMP1 y la tinción de lysotracker. Interesantemente, observamos que los lisosomas se acoplan a la membrana plasmática al inhibir ABL, sugiriendo un incremento en el proceso de exocitosis lisosomal. Estos resultados indican que el incremento tanto del flujo autofágico, la cantidad de lisosomas como la de exocitosis lisosomal, procesos regulados por la activación de TFEB, son eventos rio abajo de la inhibición ABL.

Por otro lado, evaluamos si esta activación de TFEB por la inhibición de ABL era dependiente o independiente de mTORC1. Para ello, evaluamos los niveles de fosforilación de las serinas 142 y 211 de TFEB utilizando anticuerpos específicos para estas serinas fosforiladas. Encontramos que el inhibidor de ABL no produce cambios en los niveles de fosforilación de la serina 142, y si reduce los niveles en la serina 211 deTFEB. Evaluamos la actividad de mTORC1 analizando la fosforilación de proteínas blanco de mTORC1, y en forma coherente con los resultados anteriores observamos que inhibidores de ABL, Imatinib o Nilotinib, no generan cambios en la actividad de mTORC1. Estos resultados indican que la inhibición de ABL activa a TFEB independiente de la actividad mTORC1.

Posteriormente, evaluamos si la tirosina quinasa ABL podría fosforilar en tirosina a TFEB. Mediante inmmuno precipitación de TFEB y un ensayo de fosforilación in vitro,encontramos que la actividad de ABL es suficiente para promover un incremento en los niveles de fosforilación en tirosina de TFEB. Por otro lado, encontramos mediante mutaciones sitio dirigidas de TFEB que la tirosina 173 es relevante para mantener a TFEB en el citoplasma e impacta en los niveles fosforilación en S211. Nuestros resultados muestran por primera vez que ABL fosforila a TFEB en tirosina y que estas fosforilaciones son relevantes para su localización citoplasmática. Debido a que ABL fosforila a TFEB en tirosina y su inhibición promueve su translocaciónal núcleo, quisimos evaluar si esta vía de señalización tendría un impacto en la limpieza celular, un fenómeno regulado por TFEB. En distintos modelos celulares en los cuales primero se promovió la acumulación de colesterol lisosomal, observamos que la inhibición de ABL promueve la limpieza celular de este colesterol acumulado. Interesantemente,este fenómeno no ocurre al utilizar células nulas para TFEB, indicando que la inhibición de ABL promueve la limpieza celular a través de la activación de TFEB. Posteriormente, evaluamos si esta vía de señalización ABL/TFEB participa en la acumulación de colesterol lisosomal en modelos de la enfermedad lisosomal de NPC. Encontramos en fibroblastos de pacientes de NPC que la quinasa ABL está activa, y que su inhibición promueve tanto la reducción en la acumulación de colesterol como la translocación de TFEB al núcleo.

Esto se correlacionó con un incremento en los niveles de lysotracker y Lamp1 y de la expresión de genes blanco de TFEB en fibroblastos de pacientes NPC tratados con Imatinib y Nilotinib.Finalmente, corroboramos mediante modelos in vivo de la enfermedad que la inhibición o ausencia de ABL promueve la reducción de acumulación de colesterol y la translocación de TFEB al núcleo en las neuronas de purkinje. En resumen, hemos encontrado una nueva vía de señalización que involucra a ABL y TFEB.

La inhibición de ABL promueve la translocación de TFEB al núcleo, incrementando la expresión de genes lisosomales y promoviendo la limpieza celular de colesterol en modelos de la enfermedad de NPC. De esta manera, la inhibición de la vía de señalización ABL/TFEB emerge como un blanco terapéutico no sólo para NPC, sino que también para las diversas enfermedades en las que la función lisosomal se ve disminuida.

 

Tesis (Doctor en Ciencias Biológicas mención en Biología Celular y Molecular)–Pontificia Universidad Católica de Chile, 2019.

Pablo Andrés Contreras Soto

 


Fuente: http://bit.ly/2FJi1jF


 

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